Efecto de vesículas extracelulares pequeñas (sEVs) aisladas de una línea celular endometrial sobre la modulación del desarrollo y calidad de embriones bovinos preimplantacionales

Muñoz Acuña, Erwin

Arias Cea, María Elena

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2024

59 hojas : figuras, imágenes, tablas

Doctor en Ciencias mención Biología Celular y Molecular Aplicada

Doctor en Ciencias mención Biología Celular y Molecular Aplicada

La producción in vitro de embriones (PIV) bovinos, ha permitido hacer investigación en embriogénesis animal y mejorar la reproducción en el ganado. La fertilización in vitro (FIV) es la principal técnica para la producción de embriones bovinos. No obstante, su eficiencia en términos de desarrollo y calidad embrionaria sigue siendo baja, en relación con en otras especies animales. Durante la última década un nuevo enfoque ha comenzado a tomar cada vez más fuerza y a considerarse para mejorar la producción de embriones in vitro. Se trata de la comunicación mediada por pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) con un diámetro menor a 250 nm. Diferentes trabajos han reportado que las sEVs pueden ser cruciales en la modulación del desarrollo y calidad embrionaria. Las sEVs median la comunicación entre el embrión y las células maternas, transportando cargas de proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, etc. Esto genera cambios a nivel metabólico y de expresión génica en los embriones. Al presente, en la PIV se ha evaluado el efecto de sEVs aisladas desde distintas fuentes, como por ejemplo, fluido oviductal, observándose un impacto positivo en términos de desarrollo hasta el estadio de blastocisto y en la calidad embrionaria. Sin embargo, la efectividad de las sEVs sobre la PIV, puede variar debido a la variabilidad de las muestras provenientes desde los mataderos, dada la influencia de factores como la edad de los animales, la genética, la alimentación, entre otros. Una interesante alternativa para disminuir la variabilidad, consiste en aislar sEVs desde líneas celulares establecidas. Las líneas celulares resultan idóneas para este objetivo debido a su homogeneidad morfofisiológica y genética. Adicionalmente, lo propuesto permitiría acabar también con la dependencia de muestras desde mataderos y el riesgo de transmisión de enfermedades. En diferentes especies, las sEVs secretadas por las células endometriales han demostrado tener efectos beneficiosos sobre el desarrollo y calidad de los embriones producidos in vitro. Además, se ha reportado que las sEVs endometriales pueden disminuir el estrés oxidativo en los embriones, regulando genes que codifican para enzimas antioxidantes. En la presente tesis doctoral, se aislaron y caracterizaron desde el sistema reproductor femenino bovino, células oviductales epiteliales (BOEC), células endometriales estromales (CEES) y células endometriales epiteliales (CEEP), lo que permitió indagar en el efecto modulador de las sEVs secretadas in vitro por estas células sobre el desarrollo y calidad de embriones bovinos producidos in vitro. Luego, con el fin de poder aumentar la cantidad de pasajes posibles de las CEES y CEEP, sin que pierdan sus características fenotípicas, se construyó un vector plasmídico para llevar a cabo la inmortalización de ambos tipos celulares mediante la transfección con el gen TAg, que codifica para el Antígeno T grande del virus SV40. Además, para aumentar la cantidad de sEVs secretadas por las CEES y CEEP se knockeó, mediante la tecnología CRISPR-Cas9, el gen NDRG1 que está implicado en la producción de exosomas y en el control del ciclo celular. A continuación, se evaluaron los efectos de las sEVs producidas por ambos tipos celulares inmortalizados sobre la modulación del desarrollo y calidad de embriones bovinos preimplantacionales generados por IVF. Finalmente, se caracterizó el contenido de ARNm de las sEVs secretadas por las BOEC, CEES y CEEP inmortalizadas. Los resultados mostraron que las sEVs proveniente de las CEEP tienen efectos positivos estadísticamente significativos sobre el desarrollo embrionario en términos de tasa de clivaje (control 80,8% y sEVs-CEEP 95,9%) y formación de blastocistos (control 28,8% y sEVs-CEEP 43,5%), con respecto al control no suplementado con sEVs, el cual se conservó luego de la inmortalización y edición del gen NDRG1 en las CEEP. Además, en términos de calidad, se observó que genes como el CASP3, implicado en la apoptosis intrínseca, disminuye en los embriones suplementados con sEVs. Por otro lado, se identificaron transcritos de varios genes implicados en el desarrollo embrionario en el interior de las sEVs, como OCT4, CDX2, DNMT1, IFNT2, SOD1 y CAT. Se concluye que este trabajo de tesis doctoral aporta con nuevas metodologías para el aislamiento de células y sEVs, y conocimientos sobre el papel de las células endometriales y sus sEVs en la reproducción bovina, abriendo oportunidades para el desarrollo de terapias y tecnologías innovadoras en la mejora de la reproducción asistida y la producción ganadera.

The in vitro production of bovine embryos (IVP) has enabled research into animal embryogenesis and improved reproduction in cattle. In vitro fertilisation (IVF) is the main technique for the production of bovine embryos. However, its efficiency in terms of embryo development and quality remains low, relative to other animal species. During the last decade a new approach has started to gain more and more momentum and to be considered to improve in vitro embryo production. This is communication mediated by small extracellular vesicles (sEVs) with a diameter of less than 250 nm. Several studies have reported that sEVs may be crucial in modulating embryo development and embryo quality. The sEVs mediate communication between the embryo and the maternal cells, transporting loads of proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids, etc. This leads to metabolic and gene expression changes in the embryos. Currently, the effect of isolated sEVs from different sources, e.g. oviductal fluid, has been evaluated in IVP and a positive impact has been observed in terms of development up to the blastocyst stage and embryo quality. However, the effectiveness of sEVs on IVP may vary due to the variability of samples from slaughterhouses, given the influence of factors such as animal age, genetics, feeding, among others. An interesting alternative to reduce variability is to isolate sEVs from established cell lines. Cell lines are ideal for this purpose due to their morpho-physiological and genetic homogeneity. In addition, the proposed approach would also eliminate the reliance on samples from slaughterhouses and the risk of disease transmission. In different species, sEVs secreted by endometrial cells have been shown to have beneficial effects on the development and quality of embryos produced in vitro. In addition, it has been reported that endometrial sEVs can decrease oxidative stress in embryos by regulating genes encoding for antioxidant enzymes. In this PhD thesis, oviductal epithelial cells (BOEC), endometrial stromal cells (CEES) and endometrial epithelial cells (CEEP) were isolated and characterised from the bovine female reproductive system to investigate the modulatory effect of sEVs secreted in vitro by these cells on the development and quality of bovine embryos produced in vitro. Then, in order to increase the number of possible passages of CEES and CEEP, without losing their phenotypic characteristics, a plasmid vector was constructed to carry out the immortalisation of both cell types by transfection with the TAg gene, which codes for the SV40 virus large T antigen. In addition, to increase the amount of sEVs secreted by CEES and CEEP, the NDRG1 gene, which is involved in exosome production and cell cycle control, was knocked out using CRISPR-Cas9 technology. Next, the effects of sEVs produced by both immortalised cell types on the modulation of the development and quality of preimplantation bovine embryos generated by IVF were evaluated. Finally, the mRNA content of sEVs secreted by immortalised BOEC, CEES and CEEP was characterised. The results showed that sEVs from CEEP have statistically significant positive effects on embryo development in terms of cleavage rate (control 80.8% and sEVs-CEEP 95.9%) and blastocyst formation (control 28.8% and sEVs-CEEP 43.5%), with respect to the control not supplemented with sEVs, which was preserved after immortalisation and editing of the NDRG1 gene in CEEPs. Moreover, in terms of quality, it was observed that genes such as CASP3, involved in intrinsic apoptosis, decreased in embryos supplemented with sEVs. On the other hand, transcripts of several genes involved in embryonic development were identified within the sEVs, such as OCT4, CDX2, DNMT1, IFNT2, SOD1 and CAT. It is concluded that this PhD thesis work provides new methodologies for cell and sEV isolation and insights into the role of endometrial cells and their sEVs in bovine reproduction, opening opportunities for the development of innovative therapies and technologies to improve assisted reproduction and livestock production.

Producción in vitro (PIV)

Embriones bovinos

Embriogénesis animal

Fertilización in vitro (FIV)

Calidad embrionaria

Líneas celulares

Reproducción bovina

Producción ganadera

Ciencias agropecuarias

Biología celular

Biología molecular

Universidad de La Frontera, Temuco, Chile

Universidad de La Frontera, Dirección de Bibliotecas y Recursos de Información

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https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Tesis

María Elena Arriagada Melo

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