Evaluación de una estrategia de microencapsulación basada en la utilización de composito de nPSi-βCD para la carga de los polifenoles ácido cafeico y pinocembrina, principales constituyentes bioactivos presentes en el propóleos chileno

Guzmán Oyarzo, Dina Andrea

Salazar Navarrete, Luis Antonio

Español

2021

Doctorado en Ciencias mención Biología Celular y Molecular Aplicada

Doctor en Ciencias mención Biología Celular y Molecular Aplicada

La aterosclerosis es una enfermedad silenciosa y multifactorial, cuyo progreso desencadena en la aparición de patologías cardiovasculares agudas y severas que generan altos índices de discapacidad y mortalidad a nivel mundial. El avance de la enfermedad aterosclerótica conduce al estrechamiento u obstrucción del lumen vascular de grandes vasos causado por el engrosamiento de la capa intermedia de la pared arterial. Durante el establecimiento de la lesión aterosclerótica avanzada, la angiogénesis constituye un proceso relevante, debido a que se forman nuevos vasos que son frágiles que pueden romper fácilmente, lo conlleva a la formación de placas ateroscleróticas inestables que tienen mayor riesgo de ruptura, por esta razón la neoangiogénisis en la placa de ateroma representa una interesante diana farmacológica. En este contexto los polifenoles han sido estudiados, ya que poseen diversas actividades biológicas como antiinflamatorio, antiangiogénico, antioxidante y antibacterial, entre otras. Si bien los polifenoles desde el punto de vista farmacológico tienen un gran potencial, la principal desventaja es que poseen baja biodisponibilidad en el sitio deseado. Frente a esta problemática, la utilización de sistemas biocompatibles para la liberación de drogas es una estrategia que actualmente ha cobrado gran interés. Los biomateriales como por ejemplo algunos polímeros son muy utilizadas por su capacidad de encapsular y entregar eficientemente una variedad de fármacos. El objetivo de este estudio fue obtener micropartículas de nPSi-βCD cargadas con ácido cafeico y pinocembrina, principales constituyentes bioactivos de propóleos chileno, y evaluar el efecto de la microencapsulación sobre la actividad antioxidante y antiangiogénica de los polifenoles. Respecto a la metodología, se utilizaron células HUVEC expuestas a H2O2 y a tratamientos con polifenoles en solución y cargados en la micropartícula de composito. Para lo cual se incorporaron los polifenoles dentro de una micropartícula utilizando como biomaterial nPSi, quitosana y ciclodextrina. Seguidamente se evaluaron diferentes parámetros que permitieron la caracterización físico-química de la micropartícula para luego evaluar algunos parámetros de viabilidad celular principalmente mediante MTS. La evaluación del efecto antiangiogénico de los tratamientos con polifenoles en solución y microencapsulados se realizó mediante ensayos funcionales de migración y formación de estructuras tubulares en matrigel. La detección de cambios en la expresión de genes blanco asociados a la vía antioxidante y angiogénesis a través qPCR, mientras que la expresión proteica se evaluó por Western Blot. Para el análisis estadístico se utilizó test de ANOVA seguido del post-test de Dunnett, cuando los datos seguían una distribución gaussiana. En caso contrario, se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis, con post-test de Dunn’s. El nivel de significancia que fue utilizado es p £ 0.05. Los resultados obtenidos mostraron que la micropartícula de nPSi-βCD presenta una mejor liberación controlada de los polifenoles en comparación con la micropartícula nPSi (control), además es citocompatible hasta concentraciones de 0,25 mg/mL. Por lo tanto, es apropiada para ser utilizada como una sistema de transporte y liberación controlada de ácido cafeico y pinocembrina. Se demostró que ácido cafeico y pinocembrina, presentan actividad antioxidante y antiangiogénica tanto en solución como microencapsulados. En ácido cafeico se observó un efecto biológico mayor en comparación a pinocembrina, especialmente cuando está incorporado a la micropartícula de composito nPSi-βCD. Por último, en células HUVEC tratadas con ácido cafeico y pinocembrina encapsulados, se observaron cambios en la expresión génica de Akt y Glut-P. Sin embargo, estos cambios no se observan en la expresión de las proteínas analizadas. Finalmente, en base la evidencia antes mencionada, la micropartícula de composito nPSi-βCD podría ser utilizada como un sistema alternativo de administración oral de fármacos, pues permite una liberación controlada, pudiendo de esta forma mejorar la biodisponibilidad de ácido cafeico y pinocembrina y eventualmente otros polifenoles con potencial terapéutico.

Atherosclerosis is a silent and multifactorial disease, the progress of which triggers the appearance of acute and severe cardiovascular diseases that generate high rates of disability and mortality worldwide. The progression of atherosclerotic disease leads to narrowing or obstruction of the vascular lumen of the great vessels caused by thickening of the intermediate layer of the arterial wall. During the establishment of the advanced atherosclerotic lesion, angiogenesis constitutes a relevant process, because new vessels are formed that are fragile that can easily break, leading to the formation of unstable atherosclerotic plaques that have a greater risk of rupture, for this reason neoangiogenesis in the atheroma plaque represents an interesting pharmacological target. In this context, polyphenols have been studied, since they have various biological activities such as anti-inflammatory, anti-angiogenic, antioxidant and antibacterial, among others. Although polyphenols have great pharmacological potential, the main disadvantage is that they have low bioavailability at the desired site. Faced with this problem, the use of biocompatible systems for drug delivery is a strategy that is currently gaining great interest. Biomaterials such as some polymers are widely used for their ability to encapsulate and efficiently deliver a variety of drugs. The objective of this study was to obtain microparticles of nPSi-βCD loaded with caffeic acid and pinocembrin, the main bioactive constituents of Chilean propolis, and to evaluate the effect of microencapsulation on the antioxidant and antiangiogenic activity of polyphenols. Regarding the methodology, HUVEC cells exposed to H2O2 and to treatments with polyphenols in solution and loaded in the composite microparticle were used. For which the polyphenols were incorporated into a microparticle using nPSi, chitosan and cyclodextrin as biomaterial. Next, different parameters were evaluated that allowed the physical-chemical characterization of the microparticle to later evaluate some parameters of cell viability, mainly through MTS. The evaluation of the antiangiogenic effect of the treatments with polyphenols in solution and microencapsulated was carried out through functional tests of migration and formation of tubular structures in matrigel. The detection of changes in the expression of target genes associated with the antioxidant pathway and angiogenesis through qPCR, while the protein expression was evaluated by Western Blot. For statistical analysis, ANOVA test was used followed by Dunnett's post-test, when the data followed a Gaussian distribution. Otherwise, the Kruskal-Wallis test was applied, with Dunn’s post-test. The level of significance that was used is p £ 0.05. The results obtained showed that the nPSi-βCD microparticle has a better controlled release of polyphenols compared to the nPSi microparticle (control), and it is also cytocompatible up to concentrations of 0.25 mg / mL. Therefore, it is suitable to be used as a transport system and controlled release of caffeic acid and pinocembrin. Caffeic acid and pinocembrin were shown to have antioxidant and antiangiogenic activity both in solution and microencapsulated. In caffeic acid, a greater biological effect was observed compared to pinocembrin, especially when it is incorporated into the nPSi-βCD composite microparticle. At last, in HUVEC cells treated with encapsulated caffeic acid and pinocembrin, changes were observed in the gene expression of Akt and Glut-P. However, these changes are not observed in the expression of the proteins analyzed. Finally, based on the evidence cited above, the nPSi-βCD composite microparticle could be used as an alternative oral drug administration system, as it allows a controlled release, thus improving the bioavailability of caffeic acid and pinocembrin and eventually others. polyphenols with therapeutic potential.

Aterosclerosis

Angiogénesis

Polifenoles

Liberación controlada de fármacos

Biomateriales

Microencapsulación

Ácido cafeico

Pinocembrina

Antioxidantes

Actividad antiangiogénica

Nanopartículas

Propolis

Biodisponibilidad

Células endoteliales

Sistemas de administración de fármacos

Biocompatibilidad

qPCR

Western blot

Cultivo celular

HUVEC

Biología celular

Biología molecular

Universidad de La Frontera, Temuco, Chile

Universidad de La Frontera, Dirección de Bibliotecas y Recursos de Información

Universidad de La Frontera, Centro de Biología Molecular y Farmacogenética

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Tesis

María Elena Arriagada Melo